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胰岛素对糖尿病视网膜病变的影响和其机制研究

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上海交通大学博士学位论文姨岛素对糖渌病性视两摸病变的影响及其枫钠研究 胰岛素对糖尿病性视网膜病变的影响及其机制研究 中文摘要 糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病的严重并发症之一,在发达国家DR 致盲已经位居致盲性眼病的前列。在我国,随着经济的发展和生活水*的 提高,DR的患病率正迅速升高。DR的防治已成为我国现阶段眼科医生和流 行病专家共同的重要任务。 高血糖是引起DR的主要因素。血糖的控制对于DR及其原发病糖尿病 的治疗都是重中之重。胰岛素是最常用的控制血糖的药物,临床上发现胰 岛素在控制全身血糖的同时,其加强治疗导致l型和2型糖尿病患者视网 膜病变的短暂恶化。 流行病学上,胰岛素治疗已成为DR进展的独立危险 因素。其中的机制不明。最新研究报道胰岛素诱导患者网膜血管内皮生长 因子(VEGF)表达升高导致血视网膜屏障破坏从而参与糖尿病视网膜病变 的进程。 为了了解胰岛素在正常糖和高糖环境下对视网膜VEGF表达的影响及其 机制,本研究联合进行体外和体内研究,体外研究通过体外培养的牛视网 膜微血管内皮细胞(BREC),探索正常糖(5mM)和高糖(30raM)环境下胰 岛素对BREC生长的影响,活性氧产生、凋亡的影响;VEGF mRNA和蛋白表 达的影响及其信号机制;体内研究采用链尿佐菌素(STZ)诱导的糖尿病SD 大鼠,探索胰岛素作用于正常柠檬酸缓冲液对照SD大鼠和STZ诱导的糖尿 病SD大鼠后VEGF mRNA和蛋白表达的影响。VEGF mRNA通过Realtime-PCR 检测;VEGF蛋白通过免疫组化、Western blot、HUVEC增殖实验等方法检 测;ROS通过特异性荧光燃料H:DCFDA联合激光共聚焦显微镜和流式细胞仪 观察;细胞凋亡则通过荧光燃料Annexin V和PI联合流式细胞仪观察。 在正常糖浓度下,胰岛素在体内和体外均显著上调VEGF mRNA和蛋白 IV 上海交通大学捧士学位论文胰岛泵对糖渌弱性视两膜耨燹鹃影响及其枫锄研冤 的水*。然而在高糖浓度下,胰岛素在体内和体外都并不能显著上调VEGF mRNA和蛋白的水*。高糖下胰岛素主要通过PI一3K信号通路诱导VEGF的表 达。在体外,胰岛素在正常糖和高糖下均能显著提高BREC活性氧的产生, 并且胰岛素联合高糖作用后产生ROS显著高于胰岛素或高糖的单独作用。 胰岛素在正常糖和高糖浓度下都能显著抑制BREC凋亡。 上述结果提示高糖减弱胰岛素诱导的VEGF mRNA和蛋白表达,因此VEGF 可能不是强化胰岛素治疗导致DR恶化的主要因素,胰岛素在高糖下诱导的 大量活性氧的产生可能是引起视网膜病恶化的原因之一。 [关键词】糖尿病性视网膜病变,内皮细胞,链脲佐菌素,视网膜,血管, 胰岛素 氧化应激、胶原合成、细胞增殖与分化等相关。Western印迹法证实 高脂血症组大鼠胰腺组织精氨酸酶II表达较正常胰腺组织明显增强, 0【.淀粉酶表达较正常胰腺组织明显减弱。 结论 成功构建高脂血症大鼠模型。利用蛋白质组学技术,从整体角度 将蛋白质变化综合在一起,得到高脂血症大鼠胰腺组织的蛋白质组特 征性变化。在高脂血症大鼠的胰腺病理生理改变中,差异表达的蛋白 质可能通过脂肪消化、细胞能量代谢、氧化应激、胶原合成、细胞增 殖与分化等途径对胰腺组织造成损伤,这些蛋白质的改变可能成为高 甘油三酯对胰腺损伤的早期预警标志。 关键词胰腺,高脂血症,相差凝胶电泳 第二部分高脂血症合并急性胰腺炎的胰腺组织蛋白质组学分析 研究背景与目的 急性胰腺炎在临床发病率日渐增高,高脂血症是继胆源性和酒精 源性之后急性胰腺炎的又一重要病因,脂质毒性不仅是作为急性胰腺 炎的病因,而且能进一步加重急性胰腺炎的病情。本实验通过高脂血 症大鼠为实验动物,诱导高脂血症大鼠合并急性水肿性胰腺炎和高脂 血症合并急性坏死性胰腺炎动物模型,利用双向凝胶电泳质谱技术, 寻找高脂血症合并急性胰腺炎状态下胰腺组织的差异表达蛋白,并对 这些差异表达蛋白分子进一步深入研究,以探讨高脂血症加重急性胰 腺炎的胰腺组织病理生理变化的分子机制。 方法 采用断乳一周雄性SD大鼠,随机分成二组,每组10只。其中 一组为高脂血症组,饲以高脂饮食,对照组饲以普通饲料。试验6周 后高脂组和对照组均分别予雨蛙肽腹腔内注射和牛磺胆酸钠胰管内 注射,分别建立急性水肿性胰腺炎和急性坏死性胰腺炎模型,造模后 9h处死动物,取胰腺组织,裂解提取蛋白质。采用相差凝胶电泳 (DIGE),检测高脂血症合并急性胰腺炎组与对照组的蛋白质差异。 采用免疫组化验证差异明显的蛋白质表达情况。 结果 高脂血症合并急性水肿性胰腺炎和高脂血症合并急性坏死性胰 腺炎动物模型胰腺组织有典型组织病理学改变。通过DeCyder6.5图 像分析软件进行匹配,高脂血症急性坏死性胰腺炎组与正常血脂急性 坏死性胰腺炎组分析到59个差异点,39个差异点经质谱成功鉴定, 23个点在高脂血症急性坏死性胰腺炎组上调,16个点下调。高脂血 症急性水肿性胰腺炎组与正常血脂急性水肿性胰腺炎组分析到12个 差异点,7个差异点经质谱成功鉴定,2个点在高脂血症急性水肿性 胰腺炎组上调,5个点下调。差异蛋白质主要包括代谢酶类(脂肪酶、 淀粉酶、水解碳水化合物的羧基多肽酶、0【1抗胰蛋白酶),内质网 应激和钙代谢相关蛋白质(GI冲78、HSP60、蛋白二硫键异构酶、钙 网蛋白、膜联蛋白),以及与DNA损伤修复、细胞凋亡、循环* 信号传导通路等相关蛋白质。淀粉酶和GRP78免疫组化验证结果与 电泳结果一致。 结论 应用相差凝胶电泳和二级质谱的蛋白质组学手段筛选到内质网 应激、细胞凋亡等相关蛋白质在高脂血症性急性胰腺炎中的差异表 达。高脂血症对急性胰腺炎的损伤加重通过多种途径,且高脂血症对 急性坏死性胰腺炎与急性水肿性胰腺炎的损伤加重机制不同。内质网 应激途径可能是高脂血症加重急性胰腺炎最主要的途径之一,内质网 应激相关蛋白质可能作为高脂血症相关重症急性胰腺炎的早期预警


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